INTRODUCCIÓN
⌅Los endófitos son un grupo específico de microorganismos que viven sin causar daño en el interior de células o tejidos de plantas superiores. Dentro de este grupo se destacan las bacterias, que pueden ayudar a controlar ataques de patógenos, insectos y nematodos, debido a que identifican la presencia de estos organismos en la planta de una manera rápida y ayudan en el desencadenamiento del fenómeno de inducción del sistema de resistencia sistémica (Kloepper & Ryu, 2006Kloepper, J. W., & Ryu, C.-M. (2006). Bacterial endophytes as elicitors of induced systemic resistance (Schulz BJE, Boyle CJC&Sieber TN). Springer-Verlag, Berlin, Germany.).
Las bacterias endófitas pueden ayudar a las semillas a germinar e incrementar el crecimiento de vitroplantas. Todo esto es posible por la capacidad de las bacterias de sintetizar sustancias metabólicas como antibióticos y fungicidas, así como otros metabolitos secundarios que incluyen antivirales y agentes inmunosupresores (Sánchez et al., 2018Sánchez, B. A., León, G. de A. D., Aranda, O. S., Zavaleta, M. E., Nava, D. C., Goodwin, P. H., & Leyva, M. G. (2018). Bacterias endófitas de la raíz en líneas de maíces tolerantes y susceptibles a sequía. Revista mexicana de fitopatología, 36(1), 35-55, ISSN: 0185-3309, DOI: https://dx.doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.1710-3 ).
Gluconacetobacter diazotrophicus (Gd) es un endófito bacteriano natural en caña de azúcar y otros cultivos de importancia económica (Arencibia et al., 2006Arencibia, A., Estevez, Y., Vinagre, F., Bernal, A., Perez, J., Carmona, E., Hemerly, A., & Santana, I. (2006). Induced-resistance in sugarcane against pathogenic bacteria Xanthomonas albilineans mediated by an endophytic interaction. Sugar Tech, 8(4), 272-280, ISSN: 0974-0740.). Aparte de ser un microorganismo fijador de nitrógeno atmosférico y producir fitohormonas, ha sido informado su potencial como control biológico de importantes agentes patógenos, entre ellos la bacteria Xanthomonas albilineans (Xa), agente causal de la escaldadura foliar, una de las enfermedades de mayor importancia a nivel mundial en las áreas de agricultura cañera (Piñón et al., 2002Piñón, D., Casas, M., Blanch, M., Fontaniella, B., Blanco, Y., Vicente, C., Solas, M. T., & Legaz, M. E. (2002). Gluconacetobacter diazotrophicus, a sugar cane endosymbiont, produces a bacteriocin against Xanthomonas albilineans, a sugar cane pathogen. Research in Microbiology, 153(6), 345-351, ISSN: 0923-2508.).
La búsqueda de resistencia a enfermedades por diferentes vías es un criterio primario para la selección de variedades, este aspecto reviste especial importancia en las estrategias de manejo para la agricultura cañera sostenible. El objetivo de este trabajo fue caracterizar fitopatológica, histológica y molecularmente la interacción endófito-caña de azúcar-patógeno.
MATERIALES Y MÉTODOS
⌅Tratamientos
⌅Se seleccionaron vitroplantas de los cultivares con reacción de resistencia contrastante a la enfermedad escaldadura foliar: C1051-73 (susceptible) y C90-469 (resistente), los que se encontraban en bandejas en fase de adaptación a término (45 días) en la biofábrica de caña de azúcar del INICA localizada en Villa Clara. Las plantas se llevaron a vivero en la Estación Experimental de Jovellanos. La distancia entre cada una fue de 50cm a modo de evitar sobrepoblación y competencia.
Se plantaron cinco surcos de cada variedad con cuatro réplicas, cada uno con diez plantas por tratamiento: 1) control sano, 2) inoculadas con Xa, 3) inoculadas con Gd y 4) inoculadas con Gd y Xa. A los dos primeros se les aplicó agua destilada a punto de goteo al momento de la plantación. Posteriormente todas las plantas se mantuvieron con riego días alternos hasta los cuatro meses.
Inóculos bacterianos
⌅El inóculo de la cepa 166-I de Gd se obtuvo, mediante la multiplicación por 24 horas en medio Papa-P líquido (Cavalcante & Dobereiner, 1988Cavalcante, V. A., & Dobereiner, J. (1988). A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant and soil, 108(1), 23-31, ISSN: 1573-5036.). La concentración obtenida fue de 2x108 ufc·mL-1. La inoculación de las plantas se realizó, mediante punción de la zona de crecimiento apical con aguja de jeringuilla de 1mL de capacidad. Posteriormente, la suspensión se asperjó por toda el área foliar hasta punto de goteo. Quince días después se realizó la inoculación de la bacteria patógena X. albilineans, por el método de decapitación, en los tratamientos dos y cuatro. Se empleó la cepa 74-Xa a una concentración de 3x108 ufc·mL-1. El inóculo se obtuvo por la multiplicación de la bacteria en medio Wilbrink modificado líquido con agitación constante por 72 h (Rott et al., 1995Rott, P., Soupa, D., Brunet, Y., Feldmann, P., & Letourmy, P. (1995). Leaf scald (Xanthomonas albilineans) incidence and its effect on yield in seven sugarcane cultivars in Guadeloupe. Plant pathology, 44(6), 1075-1084, ISSN: 0032-0862.).
Evaluaciones realizadas
⌅Se realizaron muestreos mensuales y se registró el número de plantas con síntomas por tratamiento y réplica de cada cultivar. A los cuatro meses posteriores a la inoculación, se determinó el porcentaje de infección (PI) como: PI = # de plantas infectadas/ # total de plantas * 100 (Jorge et al., 2011Jorge, H., Jorge, I. M., Mesa, J., & Bernal, N. (2011). Normas y Procedimientos del Programa de Fitomejoramiento de la Caña de Azúcar en Cuba [Ediciones PUBLINICA, La Habana, Cuba, pp. 308-346.].). La respuesta de los cultivares a los tratamientos se calculó de acuerdo a la escala propuesta por González et al. (2010)González, R., Carvajal, O., Tamayo, M., Montalván, J., García, J. H., Pérez, J. R., Jorge, H., Mesa, J. M., Puchades, Y., & Barroso, G. (2010). Método de evaluación de la resistencia a la escaldadura foliar de la caña de azúcar en Cuba. Revista Cuba & Caña, 1, 27-35, ISSN: 1028-6527.. Además, se midieron la altura, diámetro y peso fresco de la parte aérea de 20 plantas de cada tratamiento. Para la comparación de las medias se aplicó la alternativa no paramétrica del análisis de varianza, la prueba Kruskal-Wallis y entre parejas de grupos se utilizó la prueba de Mann-Whitney.
Análisis de PCR
⌅Se tomaron muestras de los tercios basales de cinco hojas+3 de cada tratamiento y se consideraron como muestra única. Se conservaron a -20oC para la extracción de los ácidos nucleicos totales.
El ADN total se extrajo con el Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), los que se suspendieron en agua bidestilada estéril y su calidad se monitoreó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) se emplearon cebadores específicos para cada bacteria.
Para la detección de G. diazotrophicus se utilizaron cebadores que amplifican el gen 23S ADN-ribosomal: 1440/F 5'-GTTGGCTTAGAAGCAGCC-3' y AD/R 5'-TGCGGCAAAAGCCGGAT-3’, que generan un producto de 411pb. Se realizó en un termociclador PTC100 (MJ Research, USA), con el siguiente programa de reacción: un ciclo a 94°C por 3 min; 40 ciclos a 94°C por 30 s, 56ºC por 30 s y 72°C por 1min y un ciclo final a 72°C por 5 min (Kirchhof et al., 1998Kirchhof, G., Baldani, J. I., Reis, V. M., & Hartmann, A. (1998). Molecular assay to identify Acetobacter diazotrophicus and detect its occurrence in plant tissues. Canadian Journal of Microbiology, 44(1), 12-19, ISSN: 0008-4166.).
Para la detección de X. albilineans se utilizaron los cebadores PGBL1: CTTTGGGTCTGTAGCTCAGG y PGBL2: GCCTCAAGGTCATATTCAGC que amplifican un producto de 288pb. La misma se llevó a cabo en un termociclador PTC100 (MJ Research, USA), con el siguiente programa de reacción: un ciclo a 95°C por 5 min; 40 ciclos a 94°C por 10 s, 57ºc por 10 s y 72°C por 30s y un ciclo final a 72°C por 2 min.
Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, seguido de la tinción en GelRedTM 0,001% (Biotium, EE. UU.) y visualización bajo luz U.V.
Análisis Histológicos
⌅Secciones de los tercios medios de las plantas de cada tratamiento de 1,0 cm2 se fijaron en FAA (5 mL de Formaldehído, 5ml de ácido acético, 90 mL de etanol al 70%) para los análisis histológicos.
Se realizaron cortes transversales de la lámina de la hoja a mano alzada con el auxilio de cuchilla, según la técnica de Dizeo de Strittmater D’Ambrogio de Argüeso (1986)D’Ambrogio de Argüeso, A. (1986). Manual de técnicas en histología vegetal. Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina.. Los fragmentos con un grosor de 12 a 14 µm se clarificaron mediante lavados sucesivos en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (v/v).
Se utilizó azul de cresilo (3 µg·mL-1) para determinar la presencia de celulosa en las paredes primarias y el citoplasma según Perez & Tomasi (2002)Perez, A. N., & Tomasi, V. H. (2002). Tinción con azul brillante de cresilo en secciones vegetales con parafina. Bol. Soc. Argentina Botánica, 37, 211-215, ISSN: 0373-580X., así como la presencia de lignina con safranina-verde rápido (3 µg· mL-1). Se realizaron preparaciones semipermanentes en portaobjetos con agua-glicerina 1:1 (v/v) según Debes (2013)Debes, M. A. (2013). Mejoramiento vegetal de frutillas (Fragaria x ananassa) a partir de germoplasma silvestre relacionado [Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas]. Universidad Nacional de Tucumán (UNT), Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo (INSIBIO-CONICET), Tucumán, Argentina. y se observaron en microscopio óptico (Leica DM 500, Alemania) y fotografiadas con cámara digital Sony DSC-W55 (Japón).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
⌅Se demostró la patogenicidad del aislamiento bacteriano de X. albilineans, así como la efectividad de la inoculación, por el desarrollo de síntomas típicos de escaldadura foliar de la caña de azúcar. Esto se evidenció en las plantas controles de infección Xa, en el cultivar susceptible C1051-73, a partir de los quince días posteriores a la inoculación hasta su muerte, por lo que este tratamiento no se tuvo en cuenta para el análisis estadístico, a los cuatro meses postinoculación (Tabla 1).
| Factores de variación | Grados Libertad | Altura | Diámetro | Peso fresco | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SC | SC | SC | |||||
| Repeticiones | 5 | 98,71 | ns | 0,19500 | ns | 1699,97 | ns |
| Variedad (Var) | 1 | 704,17 | 0,73500 | ** | 8694,43 | ** | |
| Tratamiento (Tto) | 1 | 13,50 | ns | 0,10667 | ns | 351,14 | ns |
| Var*Tto | 1 | 24,00 | ns | 0,01500 | ns | 786,61 | ns |
| Error | 20 | 555.67 | 0.56333 | 6730.12 |
SC: Suma de cuadrados, **: significación estadística para p≤0.05, ns: no significativo.
Los resultados indican que con la aplicación de G. diazotrophicus se logra protección de las plantas susceptibles, sin variar los parámetros morfológicos de las mismas por inducir el efecto de resistencia sistémica adquirida.
Se confirmó la ausencia de ambas bacterias en los controles sanos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. También, la presencia de G. diazotrophicus, en los tratamientos inoculados con este endófito (Figura 1A) que corroboran los resultados de la detección histoquímica. En el caso de X. albilineans (Figura 1B), se amplificó un producto con la talla esperada (288pb) en los controles de infección del cultivar susceptible. En tanto en los tratamientos que presentaban Gd, disminuyó su intensidad a partir de los quince días de inoculadas las plantas y en el cultivar resistente. Esto concuerda con los resultados de los chequeos fitopatológicos hasta la última evaluación realizada, a los cuatro meses postinoculación.
En los cortes transversales de la lámina de hojas de los controles sanos del cultivar C1051-73 no se observan inclusiones citoplasmáticas en las células del parénquima, alrededor de los haces vasculares (Figura 2A, B). Sin embargo, a los 30 días posteriores a la inoculación del endófito G. diazotrophicus (tratamiento 2: control Gd) aparecen sustancias de aspecto refringente (Figura 2C, D, E), que se incrementan en las plantas con el tratamiento Gd+Xa (Figura 2F, G, H).
La acción de Gd sugiere que el patógeno no haya podido establecerse, lo que concuerda con los resultados de los análisis fitopatológicos con ausencia de síntomas de la enfermedad en el cultivar susceptible y la disminución de la intensidad del fragmento de ADN específico amplificado por PCR.
En cuanto a los sitios que coloniza Gd y su distribución en el interior de la planta de caña de azúcar aún no se han esclarecido. Se ha demostrado que coloniza los espacios intercelulares de la raíz y los vasos del xilema (Loiret et al., 2004Loiret, F. G., Ortega, E., Ortega, R. P., Rodés, R., & De la Fuente, E. (2004). Gluconacetobacter diazotrophicus es todavía un dilema para la ciencia. Revista Biología, 18(2), 113-122.).
Por otra parte, autores como Compant et al. (2010)Compant, S., Clément, C., & Sessitsch, A. (2010). Plant growth-promoting bacteria in the rhizo-and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biology and Biochemistry, 42(5), 669-678, ISSN: 0038-0717., plantean que el control biológico de bacterias y hongos patógenos por parte de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal se lleva a cabo por competencia (de espacio, nutrientes, agua, luz, oxígeno) o mediante interacciones amensalistas como la producción de antibióticos o toxinas específicas como las bacteriocinas.
Se demostró que en el cultivar susceptible perduran hasta los cuatro meses los efectos de Gd como protector de la infección a escaldadura foliar, lo cual corroboró los resultados de Arencibia et al. (2006)Arencibia, A., Estevez, Y., Vinagre, F., Bernal, A., Perez, J., Carmona, E., Hemerly, A., & Santana, I. (2006). Induced-resistance in sugarcane against pathogenic bacteria Xanthomonas albilineans mediated by an endophytic interaction. Sugar Tech, 8(4), 272-280, ISSN: 0974-0740. sobre la inducción diferencial de respuesta adquirida por las plantas en etapas tempranas de la interacción. Este aspecto abre nuevas oportunidades para el control de la enfermedad en áreas comerciales del cultivo.
CONCLUSIONES
⌅Los resultados obtenidos en los diferentes niveles estudiados de la interacción Xa/Gd/caña de azúcar evidencian la adquisición de resistencia sistémica ante el patógeno Xa en el cultivar susceptible C1051-73, el cual no desarrolló síntomas de escaldadura foliar durante el periodo de estudio de cuatro meses abarcado por el trabajo