PHOTORHABDUS LUMINESCENS SIMBIONTE DEL NEMATODO
ENTOMOPATOGENO HETERORHABDITIS AMAZONENSIS
PHOTORHABDUS LUMINESCENS SYMBIONT OF THE ENTOMOPATOGENIC NEMATODE HETERORHABDITIS AMAZONENSIS
Juana Pérez-Pérez, Lisset Pozo-Martínez, Diagne Casañas-Canino, Mario
Casas-González, María La O-Hechavarría, Yaimi Blanco-Machado y Mérida
Rodríguez-Regal
E
mail: juana.perez@inica.azcuba.cu
RESUMEN
Photorhabdus
luminescens es una bacteria entérica, que vive en asociación
simbiótica con nematodos del suelo y es altamente patogénica para un amplio número
de insectos. La bacteria es
transportada en el tracto digestivo del nematodo y una vez que este ingresa en
el insecto huésped por aberturas naturales (boca, ano y espiráculos) regurgita
la bacteria en la hemolinfa del insecto, el que muere por septicemia entre las
24-48 horas. El objetivo del trabajo fue aislar la bacteria Photorhabdus luminescens a partir del nematodo Heterorhabditis amazonensis. Los aislamientos se
realizaron a partir de la siembra del macerado de larvas de Galleria mellonella previamente
inoculadas con el nematodo, en
placas de Petri con medio de cultivo NBTA. Se realizó la caracterización
morfológica y bioquímica de las colonias seleccionadas; así como pruebas in vivo para
determinar la patogenicidad de la bacteria sobre larvas de G. mellonella. Las
colonias obtenidas presentaron la bioluminiscencia característica de la especie
bacteriana, al ser sometidas a la acción de la luz ultravioleta. Se observaron colonias
pequeñas a medianas, con bordes regulares, convexas, brillosas, de color
verdoso que se van tornando de color rojo. La mayor mortalidad de las larvas de
ocurre entre las 48 a 72 horas de exposición a la bacteria.
Palabras clave: Photorhabdus luminescens, Nematodos, Control Biológico
Photorhabdus
luminescens is an enteric bacterium, that lives in symbiotic
association with soil nematodes and is highly pathogenic for a wide number of
insects. The bacterium is transported in the digestive tract of the nematode
and once it enters the host insect through natural openings (mouth, anus and
spiracles), it regurgitates the bacteria in the hemolymph of the insect, which
dies from sepsis between 24-48 hours. The objective of the work was to isolate
the Photorhabdus luminescens bacteria
from the nematode Heterorhabditis amazonensis.
The isolations were carried out by sowing the macerate of Galleria mellonella larvae previously inoculated with the nematode,
in Petri dishes with NBTA culture medium. The morphological and biochemical
characterization of the selected colonies was carried out; as well as in vivo
tests to determine the pathogenicity of the bacteria on G. mellonella larvae. The colonies obtained presented the
characteristic bioluminescence of the bacterial species, when subjected to the
action of ultraviolet light. Small to medium-sized colonies were observed, with
regular, convex, shiny, greenish color edges that gradually turn red. The
greatest mortality of the larvae occurs between 48 to 72 hours of exposure to
the bacteria.
Key
Word: Photorhabdus luminescens, Nematodes, Biologic Control
INTRODUCCIÓN
Los nemátodos entomopatógenos son utilizados
como biocontrol contra una amplia variedad de insectos plagas de importancia
económica (Koppenhöfer et al., 2020;
Shapiro-Ilan et al., 2017). Los
nematodos matan a los insectos con la ayuda de las bacterias simbióticas Photorhabdus spp. and Xenorhabdus spp., asociadas con Heterorhabditis spp. and
Steinernema spp., respectivamente (Grewal et al., 2005; Shapiro-Ilan et
al., 2017). Estas bacterias producen inclusiones cristalinas proteicas,
proteasas, lipasas, lipopolisacaridos y otros compuestos activos tóxicos para
los insectos plagas (Bowen et al., 1998;
ffrench-Constant et al., 2007).
Photorhabdus
luminescens es una bacteria entérica, que vive en asociación
simbiótica con nematodos del suelo y es altamente patogénica para un amplio número
de insectos (Barrera, 2019). Son bacilos Gram-negativos, con
anaerobiosis facultativa y no se encuentran en la naturaleza de forma libre,
sino solamente en los nematodos o insectos hospedantes. Es simbiótica mutualista, porque, el nematodo no se puede
reproducir dentro del hospedante sin la acción de la bacteria, y ésta, no puede
penetrar a la hemolinfa del insecto para multiplicarse y causar la infección,
si el nematodo no la transporta (Han y Ehlers 2001).
Presenta dos fases de desarrollo, fase
I que es la fase patogénica y puede diferenciarse por la presencia de cuerpos
de inclusión, que le sirven al nematodo como fuente de alimento y fase II, que
es la fase no patogénica, no presenta cuerpos de inclusión (Arias Yapias y
Murillo, 2013; Castillo, 2016). Una característica importante de la fase I,
incluye la pigmentación, bioluminiscencia y la producción de toxinas y antibióticos
(Ffrench-Constant,
2003; Duchaud, 2003).
La bacteria P. luminescens
se aloja en el tracto digestivo del nematodo y una vez que éste ingresa en
el insecto huésped por aberturas naturales (boca, ano y espiráculos), regurgita
la bacteria en la hemolinfa del insecto. Aquí la bacteria expresa toxinas como los
complejos tóxicos (Pir AB, Mcf1 y Mcf2) y al mismo tiempo diversas enzimas
líticas (proteasas, lipasas y fosfolipasas). La acción conjunta de estas
sustancias, producen la perforación del intestino de la larva, septicemia en el
hemocele larvario y la muerte de la larva en un intervalo de 24-48
horas (Ffrench-Constant,
2003).
Esta interacción simbiótica no solamente resulta beneficiosa por
el suministro de los nutrientes necesarios por parte de la bacteria, sino que a
su vez evita la contaminación causada por otros microorganismos mediante la
producción de barreras antimicrobianas como los antibióticos (Zamora-Lagos
et al., 2018).
Photorhabdus
luminescens se está utilizando como bioinsecticida, ya que es altamente
patógena para una amplia gama de insectos (Dominelli, 2022). Contar con cepas nativas, altamente virulentas es una tarea de gran
importancia, por lo que el objetivo del trabajo fue aislar la bacteria Photorhabdus luminescens a
partir del nematodo Heterorhabditis
amazonensis.
MATERIALES Y
METODOS
Aislamiento
de la bacteria: Para el aislamiento de la bacteria, se
utilizaron larvas de Galleria
mellonella previamente inoculadas con el nematodo Heterorhabditis amazonensis.
Las larvas proceden del Centro de Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos
(CREE), de la Estación Experimental de Investigaciones de la Caña de Azúcar de
Quivicán, Provincia Mayabeque.
En el
laboratorio las larvas se desinfestaron con hipoclorito de sodio a 1 % durante
3 min, se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril y se colocaron en papel
de filtro. Con un bisturí estéril, se realizó una disección de la larva, se
tomó el tercio medio y se maceró en mortero estéril hasta total homogenización.
Se realizaron
diluciones seriadas en agua destilada estéril y se estriaron en placas de Petri
con medio de cultivo selectivo NBTA (Boemare et al., 1997). Las placas de Petri se incubaron a 28oC,
durante 72 horas. Colonias aisladas fueron seleccionadas y estriadas nuevamente
en medio de cultivo NBTA para obtener colonias puras y realizar la caracterización
de las mismas.
La pureza de
los aislamientos se confirmó mediante la tinción de Gram (Harrigan y Mc Cance, 1968),
realizada con las soluciones de la marca Fluka, Sigma-Aldrich, Alemania. Se
observó la uniformidad celular en un microscopio óptico de contraste de fases. Las
placas de Petri con las colonias obtenidas fueron mantenidas en refrigeración.
Determinación de las
características morfológicas de células y colonias: Se
procedió a la caracterización morfológica de las colonias en el medio de
cultivo NBTA y de las células bacterianas al microscopio óptico. Las
características de las colonias fueron descritas después de 48-72 horas de
incubación evaluándose: forma, cromogénesis, bordes, elevación, detalles
ópticos y consistencia. Las observaciones celulares se realizaron en
preparaciones frescas y se evaluó: forma y motilidad.
Determinación de las
características fisiológicas y bioquímicas cualitativas: A
partir de cultivos frescos se realizó la caracterización fisiológica y
bioquímica de los aislamientos con el empleo del test multiprueba Api20E (BioMerieux,
SA, Francia). Una colonia fresca se resuspendió en 5 mL de agua estéril MilliQ
hasta alcanzar la concentración del tubo 2 de la escala de McFarlan. La
suspensión bacteriana se distribuyó en los pocillos de la tira e incubó por 24
horas a 28oC.
La detección
de la actividad catalasa se realizó a partir de una emulsión de cultivo fresco
de 24 horas en peróxido de hidrógeno al 10% en un portaobjeto limpio (Eising y
Gerhart, 1987). La actividad oxidasa se realizó al añadir una gota del reactivo
clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, sobre una colonia fresca
colocada sobre un papel de filtro (McFarland, 1990).
La actividad
proteolítica se realizó mediante la siembra de la cepa en medio de cultivo Skim
milk, con el fin de observar halos
de degradación alrededor de la colonia. La cepa fue multiplicada en medio de
cultivo LB líquido (Sambrook et al.,
1989) a 28oC por 24 horas en agitación. Una parte del cultivo fue
centrifugado a 10 000 rpm x 5 min. El pellet fue resuspendido en agua estéril
MilliQ y en medio
de cultivo LB. Discos de papel de filtro se embebieron en estas suspensiones y
colocaron sobre la superficie del medio de cultivo. Se realizaron 5 réplicas
por cada tratamiento.
Conservación de cepas: Para realizar la conservación,
las cepas fueron multiplicadas en medio de cultivo LB líquido (Sambrook et al., 1989) a 28oC por 24
horas en agitación. El cultivo fue centrifugado a 10 000 rpm x 5 min. El pellet
fue re suspendido en medio de cultivo LB con 30% de glicerol y las muestras
mantenidas en frízer a -20oC.
Pruebas
in vivo de patogenicidad sobre larvas de Galleria
mellonella: Para
evaluar la actividad patogénica de la bacteria, como modelo biológico se
utilizaron larvas del insecto hospedero Galleria
mellonella. Las larvas se desinfestaron con hipoclorito de sodio a 1 % durante 3
min, se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril y colocaron sobre papel
de filtro. Una
suspensión de la bacteria en agua estéril MilliQ a la concentración del tubo 2
de la escala de McFarlan, se aplicó sobre las larvas y se dejó en contacto con
las mismas por 5 min. Se realizaron cinco réplicas a razón de 5 larvas por placa Petri y
mantuvieron a temperatura ambiente. Se evaluó el porcentaje de mortalidad y se
observó la sintomatología (disminución de la movilidad, coloración y flacidez).
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Coloración rojiza a b
Caracterización microbiológica de
colonias: Entre las 48-72 horas de incubación, se observaron
colonias que van de pequeñas a medianas, con bordes regulares, convexas,
brillosas, de color verdoso. En algunas partes comienza a aparecer zonas de
coloración rojizas (figura 1). Al ser sometidas a la luz U.V, se pudo observar
bioluminiscencia (figura 2), al ser sometidas a la acción de la luz
ultravioleta. Se seleccionó un
aislado y se sembró por agotamiento en medio de cultivo NBTA para la obtención
de colonias puras.
Figura 1.
Colonias parecidas a Photorhabdus
luminescens
en medio de cultivo NBTA. a. Colonias
de color verdoso. b. En algunas zonas se observa una coloración rojiza.
Figura
2. Bioluminiscencia en colonias parecidas a Photorhabdus
luminescens en medio de cultivo NBTA sometidas
a la luz ultravioleta.
Existen
diversidad de criterios en relación a la coloración de las colonias de Photorhabdus luminescens
en el medio de cultivo NBTA. Algunos autores describen colonias de color verde
a azul-verdoso en cultivos de 48-72 horas de crecimiento (Valdés et al., 2005; Orozco-Hidalgo,
Quevedo-Hidalgo y Sáenz-Aponte, 2019), similares a las obtenidas por nosotros, sin
embargo, Singh et al., 2012 y
Castillo, 2016) observaron colonias de color rojo oscuro a purpura en este
medio de cultivo.
El
crecimiento in vitro de la bacteria en medio de cultivo NBTA permite reconocer
dos fases asociadas a su metabolismo y patogenicidad. La fase I se caracteriza
por la producción de una serie de factores patogénicos, diferentes toxinas y
bioluminiscencia, mientras que la fase II se caracteriza por la pérdida de los
factores de patogenicidad (Nouh y Hussein, 2015; Orozco-Hidalgo, Quevedo-Hidalgo
y Sáenz-Aponte, 2019).
Caracterización microbiológica de
células: Las células son Gram (-), en forma de bacilos delgados
y motiles. Las cepas se conservaron en glicerol
30% para su utilización en estudios posteriores (figura 3).
Figura 3. Tinción de Gram (Gram -). Conservación en medio de
cultivo LB con glicerol 30%.
La capacidad
de las bacterias de degradar la caseína a compuestos nitrogenados solubles a
través de la enzima caseinasa, se evidenció con la formación de halos de
hidrólisis en el medio de cultivo Skim milk en los tratamientos 2, 3 y 5, los
que tenían presencia de la bacteria. La caseína es la proteína de la leche que
le proporciona el color, cuando se hidroliza, se ve un halo transparente
alrededor de la colonia. En los controles con agua y el medio de cultivo LB, no
se observaron halos de hidrólisis.
La presencia de proteasas es importante, porque ellas
están activamente involucradas en la ruptura de las proteínas en los insectos,
lo cual le permite a la bacteria y al nematodo simbiótico, reproducirse dentro
del insecto antes de seguir hacia el próximo (Gerdes et al., 2015).
1 2 3 4 5
Las proteasas, principalmente las de origen microbiano, constituyen el
grupo más importante de enzimas comerciales, ya que tienen gran variedad de
aplicaciones en las industrias: alimentaria, farmacéutica, cosmética, médica,
peletera, textil, entre otras. Además, estas enzimas son usadas en la
formulación de detergentes y en el manejo de residuos y procesos de
biorremediación (Paredes et al.,
2017)
Figura 4. Crecimiento en medio de cultivo Skin Milk. 1. Agua estéril
MilliQ. 2. Pellet de la bacteria resuspendido en agua estéril
MilliQ. 3. Bacteria crecida en medio de cultivo LB. 4. Medio de cultivo LB
líquido. 5. Pellet de la bacteria resuspendido en medio de cultivo LB líquido
Caracterización
bioquímica: Algunas respuestas de la cepa a los diferentes sustratos
incluidos en el test, coinciden con los de Saenz-Aponte et al. (2014) y Orozco-Hidalgo, Quevedo-Hidalgo y Sáenz-Aponte,
(2019), sobre todo aquellos que han sido descritos para todos los aislamientos
como son la utilización de la glucosa y la fuerte reacción de la enzima
catalasa. La
presencia de la enzima se evidenció por la formación de burbujas por la
liberación se oxígeno. La prueba de oxidasa resultó negativa, ya que no se
produjo el cambio a color rojo característico de la reacción positiva. Diferentes
autores informan una reacción a las enzimas oxidasa y catalasa similar a la
obtenida por nosotros (Han y Ehlers, 2001; Castillo,
2016; Machado et al., (2018), Orozco-Hidalgo,
Quevedo-Hidalgo y Sáenz-Aponte, 2019).
Tabla 1. Características bioquímicas
de aislamiento similar a Photorhabdus
luminescens con el empleo del kit Api20E
|
Características bioquímicas |
Reacción |
|
Beta-galactosidasa (ONPG) |
- |
|
Arginina deshidrolasa (ADH) |
- |
|
Lisina descarboxilasa (LDC) |
- |
|
Ornitina descarboxilasa (ODC) |
- |
|
Utilización del citrato (CIT) |
+ |
|
Producción de H 2
S (H2S) |
- |
|
Ureasa (URE) |
+ |
|
Triptófano desaminasa (TDA) |
+ |
|
Producción de indol (IND) |
- |
|
Producción de acetoína
(Voges-Proskauer) (VP) |
- |
|
Gelatinasa (GEL) |
+ |
|
Fermentación/oxidación de
glucosa (GLU) |
+ |
|
Fermentación/oxidación de
manitol (MAN) |
- |
|
Fermentación/oxidación de
inositol (INO) |
- |
|
Fermentación/oxidación de
sorbitol (SOR) |
+ |
|
Fermentación/oxidación de
ramnosa (RHA) |
- |
|
Fermentación/oxidación de
sacarosa (SAC) |
+ |
|
Fermentación/oxidación de
melobiosa (MEL) |
- |
|
Fermentación/oxidación de
amigdalina (AMY) |
- |
|
Fermentación/oxidación de
arabinosa (ARA) |
+ |
|
Citocromo
oxidasa (OX) |
- |
|
Catalasa |
+ |
|
NO2 |
+ |
+ positiva, − negativa
Dados
los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificación
fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características
homogéneas), los métodos moleculares se han erigido como procedimientos
complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos (Fernández
et al., 2010).
Patogenicidad de cepa similar
a Photorhabdus luminescens sobre
larvas de Galleria mellonella: La mayor mortalidad de las
larvas de ocurre entre las 48 a 72 horas de exposición a la bacteria. A pesar
de que aparentemente la mayor cantidad de muertes fueron debidas a
manipulación, un número importante de larvas muertas tenían una consistencia
flácida, distintiva de muerte por bacteria. La movilidad y la coloración no
tuvieron variación significativa.
Figura 5. Porcentajes de mortalidad de larvas de Galleria mellonella inoculadas con
aislamiento de Photorhabdus luminescens
Después de la inoculación la bacteria se
reproduce rápidamente y libera varios factores de virulencia, incluyendo
toxinas, proteasas, lipasas, hemolisinas y sustancias antimicrobianas. La
muerte de los insectos hospederos, generalmente ocurre dentro de las 48 h y
después el cuerpo del insecto es utilizado como fuente de alimento para la
bacteria y para el nematodo (Ffrench-Constant et al., 2003).
Wu et al.,
(2022), probaron en el laboratorio la toxicidad de los metabolitos producidos
por las bacterias Photorhabdus
luminescens y Xenorhabdus bovienii,
contra la mariquita asiática multicolor Harmonia
axyridis, el pulgón negro de la nuez Melanocallis
caryefoliae y el pulgón de margen negro Monellia
caryella. El caldo bacteriano obtenido a partir de ambas bacterias, mostró altos
niveles de toxicidad, equivalentes al insecticida piretroide Bifentrina.
La
posibilidad de obtener un bioproducto de mayor estabilidad y viabilidad
comercial a partir de la bacteria, es una herramienta prometedora para el
control biológico de insectos plagas en la agricultura.
CONCLUSIONES
Las características morfo
fisiológicas y de patogenicidad de la cepa aislada resultaron similares a las
informadas en la literatura para Photorhabdus
luminescens.
RECOMENDACIÓN
Se deberá realizar la
caracterización molecular de la cepa aislada.
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