HISTOLOGÍA DE BROTES IN VITRO DE CAÑA DE AZÚCAR (Saccharum
spp.) EN BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL.
HISTOLOGY OF IN VITRO SUGARCANE (Saccharum spp.) SHOOTS IN TEMPORARY IMMERSION BIOREACTORS.
Aydiloide Bernal Villegas1*, Marta E. Arias2,
María de la Luz la O3, Ricardo Acevedo Rojas3, Rafael
Gómez Kosky1, Mario A. Debes2, Ana C. Luque2, Atilio P. Castagnaro4.
1. Estación Territorial de
Investigaciones de la Caña de Azúcar Centro Villa Clara (ETICA Centro-Villa Clara). Instituto de
Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA). Autopista Nacional km 246,
Ranchuelo, Villa Clara, Cuba.
2.
Facultad de Ciencias
Naturales e Instituto Miguel Lillo (CSNAT). Universidad Nacional de Tucumán.
Argentina. -Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FACEN) Universidad Nacional
de Catamarca. Argentina.
3.
Instituto de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA). Instituto de
Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA) Carretera a la CUJAE, Km
1½ ,Boyeros, CP 19390, La Habana, Cuba
4.
Instituto de
Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITANOA) y Estación
Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), Tucumán, Argentina.
E
mail: aydiloide.bernal@inicavc.azcuba.cu
Resumen
Durante la
propagación in vitro de la caña de
azúcar (Saccharum spp.), inicialmente
la presencia de los fenoles se consideró como un rasgo indeseable, debido a que
su oxidación inhibe el desarrollo del explante y le provocaba la muerte. Sin
embargo, en los Biorreactores de Inmersión Temporal se determinó que los compuestos
fenólicos en el medio de cultivo líquido no afectaron la multiplicación in vitro de los brotes. El presente trabajo se
desarrolló con el objetivo analizar la
caracterización histológica de hojas
a partir de brotes in vitro de caña
de azúcar multiplicados en Biorreactores de Inmersión Temporal con presencia y
ausencia de compuestos fenólicos en el medio de cultivo.Se tomaron 10 muestras de 1,0 cm de largo de la porción media de las hojas de los brotes in vitro del
cultivar C1051-73 a los siete, 14, 21 días de cultivo. Los resultados obtenidos demuestran la asociación
entre los cambios estructurales y bioquímicos resultantes de la excreción de
compuestos fenólicos al medio de cultivo por los brotes in vitro.
Palabras clave: caña de azúcar, Biorreactores de
Inmersión Temporal, metabolitos secundarios
Abstract
During the in vitro propagation of sugarcane (Saccharum spp.), initially the presence
of phenols was considered an undesirable trait, because their oxidation
inhibits the development of the explant and caused its death. However, in the
Temporary Immersion Bioreactors it was determined that the phenolic compounds
in the liquid culture medium did not affect the in vitro multiplication of the shoots. The present work wasdeveloped
with the objective of analyzing the histological characterization of leaves
from in vitro sugarcane shoots
multiplied in Temporary Immersion Bioreactors with the presence and absence of
phenolic compounds in the culture medium. Ten 1.0 cm long samples were taking
from the middle portion of the leaves of the in vitro shoots of the C1051-73 cultivar at seven, 14, and 21 days
of culture. The results obtained demonstrate the association between the
structural and biochemical changes resulting from the excretion of phenolic
compounds to the culture medium by the in
vitro shoots.
Keywords: secondary
metabolites, sugarcane, Temporary Immersion Bioreactors
Introducción
La caña
de azúcar (Saccharum spp.) es uno de
los cultivos más importantes a nivel mundial, ocupando el quinto lugar. Con una producción de aproximadamente 1869,72 millones
de toneladas y un valor de alrededor de $57 billones de producción mundial
bruta (Zhang et al., 2018; FAO, 2022).Está distribuido en 137 países sobre
un área de 26 millones de hectáreas de tierras cultivadas, fundamentalmente en
las zonas tropicales y subtropicales (Bhuiyan et al., 2021).
En Cuba,
la caña de azúcar se encuentra distribuida a través de todo el territorio
nacional, con un área de 263645,46 ha plantadas. Según el censo anual de
cultivares realizado por el Instituto de Investigaciones de la Caña de Azúcar
(INICA) (INICA, 2023).
La biotecnología en esta especie vegetal constituye
una herramienta importante para el mejoramiento genético y la propagación
masiva. Las primeras investigaciones relacionadas con el cultivo de células y
tejidos en caña de azúcar comenzaron en 1960, en Hawai, EUA (Wekesa et al., 2015). Inicialmente en el
cultivo de tejidos tradicional, se consideró la presencia de los fenoles como
un rasgo indeseable, debido a que la oxidación inhibe el desarrollo del
explante y le provocaba la muerte (Li et
al., 2003; He, 2006).
La semi-automatización del
proceso es una alternativa más eficiente para aumentar los coeficientes de
multiplicación, la calidad de los brotes y reducción de los costos (Watt, 2012). Los Biorreactores de Inmersión
Temporal (BIT) se desarrollaron hace varias décadas, para el cultivo in vitro de brotes y raíces (Escalona et al., 1999). Estos se utilizan para la propagación in
vitro de la caña de azúcar a nivel
mundial (Lorenzo et al., 2001; Aragón
et al., 2009).
Estos proporcionan un ambiente más favorable porque brindan la posibilidad de controlar las variables
químicas y físicas dentro de los recipientes de cultivo (Watt, 2012). Sin
embargo, la presencia de fenoles y su oxidación en este tipo de frasco no provoca
afectaciones a los materiales in vitro de
caña de azúcar (Bernal et al., 2019).
Hasta el presente no se han
estudiado las condiciones de cultivo para la producción de compuestos fenólicos
a partir de los brotes in vitro de
caña de azúcar propagados en BIT. Durante muchos años, la presencia de fenoles
en el cultivo in vitro parecia ser un
factor negativo para el buen desarrollo del material trabajado. En este sentido,
Bernal et al. (2024) informaron
que estos fenoles no afectaron el crecimiento y desarrollo, por lo que su
producción le daría un valor agregado a esta metodología.
La
presente investigación tuvo como objetivo analizar la
caracterización histológica de hojas
a partir de brotes in vitro de caña
de azúcar multiplicados en BIT con presencia y ausencia de compuestos fenólicos
en el medio de cultivo.
Materiales y métodos
El material vegetal que se utilizó para
realizar los cortes histológicos fueron hojas de brotes in vitro del cultivar C1051-73 multiplicados en medio de cultivo
líquido en los Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT), compuesto por las
sales MS (Murashige y Skoog 1962) al 100%, 1 mg.L-1 tiamina, 100 mg.
L-1 de mio-inositol; 4 mg. L-1 de 6-bencil-aminopurina, 30
g. L-1 de sacarosa. El pH se ajustó a 5,6
con NaOH (1,0 N) y HCl (1,0 N) previo a la esterilización. El control con ácido ascórbico 50 mg L-1.
Las muestras se tomaron a los siete, 14, 21 días de crecimiento. Para ello se
seleccionaron 10 secciones de 1,0 cm de largo de la
porción media de la hoja.
Los cortes
transversales de la lámina de la hoja se realizaron a mano alzada con el
auxilio de cuchilla de afeitar, según la técnica de Dizeo de Strittmater
(D´Ambrogio de Argüeso, 1986). Para obtener la epidermis mediante el raspado se
siguió el protocolo de Metcalfe (1960). En ambos casos el material vegetal se
clarificó mediante lavados sucesivos en una solución
de hipoclorito de sodio al 0,5% (v/v).
Las
paredes primarias celulósicas y el citoplasma se tiñeron con azul de cresilo
brillante (3 µg mL-1) y los procesos de lignificación con
safranina-verde rápido (3 µg mL-1), según Debes (2013).
Se realizaron preparaciones semi-permanentes en portaobjetos con agua-glicerina
1:1 (v/v) y se observaron en microscopio óptico (Leica DM 500, Alemania), las
que se fotografiaron con cámara digital (Sony DSC-W55, Japón).
El conteo de tricomas incluyó toda la morfología
de apéndices exodérmicos, los que se analizaron en vista paradermal o sea
paralelos a la epidermis. La densidad de tricomas se determinó mediante el
conteo del número total de estos en 20 campos del microscopio con un objetivo
de 40X.
Además, durante este período se evaluó el
cambio de coloración en el medio de cultivo y en los brotes in vitro, el cual se estimó mediante el
código de colores hexadecimal (Anónimo, 2011). Para el análisis estadístico se
aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de clasificación simple y la diferencia
entre las medias de los grupos se determinó por la prueba de Tukey para
p≤0,05.
Resultados y discusión
Las láminas de las hojas de
los brotes in vitro del cultivar
C1051-73 multiplicadas en BIT en presencia y ausencia de compuestos fenólicos, resultaron
anatómicamente diferentes. Se observaron seis estratos de células del parénquima
a nivel del nervio medio en ausencia de estos compuestos (Figura 1A) con
respecto a aquellas que lo hicieron en ausencia del compuestos fenólicos, de
este con solo cuatro (Figura 1B).
Asimismo, en los haces
vasculares se detectaron abundantes depósitos de ligninas, lo cual se denota
por la coloración oscura de las paredes celulares de los vasos fibrovasculares
de las hojas de los brotes in vitro
cultivados en ausencia de compuestos fenólicos (control) (Figura 1A). La
coloración de estos fue más tenue en presencia de estos compuestos (Figura 1B).
Figura 1. Corte transversal de hojas de brotes in
vitro de caña de azúcar (Saccharum spp.) cultivar C1051-73,
multiplicados en BIT a los 14 días de cultivo (A) ausencia de compuestos
fenólicos y (B) presencia de compuestos fenólicos. El corchete en blanco indica
los estratos de células parenquimatosas. Observados a 40X.
Las hojas de los brotes in vitro crecidas en los BIT en ausencia
de compuestos fenólicos (control) presentaron en el interior de sus células
abundantes granos de almidón en posición parietal (Figura 2A). En el caso de
los brotes crecidos en presencia de estos compuestos, tanto en las células del
parénquima del mesófilo como en la vaina del haz vascular de las hojas, se
observaron escasos y dispersos granos de almidón (Figura 2B).
Figura 2. Corte transversal de hojas de brotes in vitro de caña de
azúcar (Saccharumspp.) cultivar C1051-73, multiplicados en Biorreactores
de Inmersión Temporal a los 14 días de cultivo (A) ausencia de compuestos fenólicos y (B) presencia
de compuestos fenólicos. Las flechas negras señalan
los granos de almidón.Observados a 40X.
Los tejidos de las hojas de los brotes in
vitro multiplicados en BIT con medio de cultivo en presencia de compuestos
fenólicos, presentaron abundante cantidad de cloroplastos, con escasa
acumulación de lignina en las paredes celulares y gránulos de almidón. Esto
último indicó una menor acumulación de almidón, que pudieron ser utilizadas
como precursores para la producción de compuestos fenólicos que se excretaron
al medio de cultivo.En vista paradermal, se observó un incremento progresivo en la densidad de
tricomas, entre los siete y 21 días de multiplicadas las hojas de los brotes in vitro en los BIT en presencia de compuestos fenólicos, con respecto a las que
estuvieron ausencia de estos (Figura 3).
Figura 3. Densidad de tricomas por mm2 en hojas de brotes in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp. cultivar C1051-73) multiplicados
en Biorreactores de Inmersión Temporala los siete, 14 y 21 días de cultivo, en
presencia o ausencia de compuestos fenólicos (control).
Barras con letras no comunes
difieren significativamente según prueba de Tukey para p≤ 0,05 Media ±EE
33,33± 0,14 (n=30).
La microscopía óptica resultó de gran utilidad para la caracterización
morfo-anatómica de las hojas de los brotes in
vitro del cultivar de caña de azúcar C1051-73 multiplicadas en los BIT, la
cual también se ha empleado con éxito para la localización de diferentes
estructuras celulares en distintas especies vegetales (Bertani et al., 2014; Aragón, 2015).
La excreción de compuestos fenólicos al medio de cultivo de los brotes in vitro de caña de azúcar crecidos en presencia
de compuestos fenólicos, se justifica por la mayor cantidad de tricomas
glandulares (pelos foliares) observados en las hojas, los cuales se
incrementaron durante los 21 días de multiplicación. Estas estructuras
estuvieron en contacto intermitente con el medio de cultivo que tomó una
coloración marrón montura (código 9993300).
Este resultado se corresponde con lo planteado por otros autores como
Ozyigit (2008) y Jianget al. (2013),
que describieron la presencia de células secretoras en los tricomas glandulares
y mayor cantidad de estas en los tejidos aéreos que en otros órganos. Por otra
parte, Wagner et al. (2004) y
Martínez y Espinosa (2005), coincidieron que el 30 % de las plantas vasculares
poseen tricomas glandulares que excretan diferentes metabolitos secundarios en
dependencia de la especie y de las condiciones de crecimiento.
Según Dixon et al. (2002), la lignina es un compuesto fenólico,
constituye uno de los componentes fundamentales de la pared celular de los
vegetales. Además, Weng y Chapple (2010), refirieron que refuerza y proporciona
rigidez a los tejidos y se deposita de manera abundante en células específicas
de las plantas como las esclereidas, traqueidas, elementos de los vasos y
fibras del xilema y floema.
Los mismos autores explicaron que los compuestos fenólicos se consideran un
mecanismo de defensa importante porque su biosíntesis y deposición en paredes
celulares se incrementa cuando las plantas son sometidas a estrés de tipo
biótico. Por sí mismo, constituye una barrera física contra el ingreso de
fitopatógenos (Lagunes y Zavaleta, 2016).
Con relación a los tricomas, Aragón et
al. (2009) plantearon que el número de estos en las hojas de los brotes in vitro de caña de azúcar del cultivar
C91-301 se incrementó con el tiempo de cultivo, durante los 21 días que duró la
propagaciónin vitro en los BIT. A su
vez, Tissier (2012) señaló que tanto el número de tricomas glandulares como no
glandulares está influenciado por el ambiente. Lo anterior justifica los
resultados obtenidos en la presente investigación.
Las paredes celulares de las hojas de los brotes in vitro de caña de azúcar del cultivar C1051-73, en presencia de
compuestos fenólicos mostraron menor lignificación, lo que contribuyó a una
mayor permeabilidad de la pared celular y por ende facilitó la excreción de estos,
a diferencia de lo que ocurrió en ausencia de compuestos fenólicos. Estos
resultados quedaron respaldados con lo descrito por Musilova et al.
(2016), relacionado con el efecto inhibitorio del ácido ascórbico sobre la
polimerización de la lignina y la acción de enzimas oxidativas.
Según Davey et al. (2000) y Pastori et al. (2003), los
cloroplastos son en la célula vegetal, el principal lugar de la síntesis de
especies reactivas de oxígeno, donde el ácido ascórbico actúa de manera clave
como agente protector frente a los efectos del estrés oxidativo. Además,
interviene en la división celular y la respuesta de la planta frente al ataque
de patógenos.
En presencia de compuestos fenólicos se observó mayor cantidad de
cloroplastos en las células del parénquima clorofílico de las hojas de los
brotes in vitro, lo cual se pudo
relacionar con la mayor excreción de los compuestos fenólicos a través de los
tricomas glandulares. Esto puede ser sustentado con lo descrito por Cartaya y
Reinaldo (2001), a cerca de la producción de estos compuestos en la membrana de
los tilacoides.
Las evidencias obtenidas en el presente trabajo, demuestran la asociación
entre los cambios estructurales y bioquímicos resultantes de la excreción de
compuestos fenólicos al medio de cultivo.
Conclusiones
·
Se demostró,
a través del análisis histológico, que las hojas de los brotes in vitro multiplicados en los BIT en
presencia de compuestos fenólicos presentaron un mayor número de tricomas, cloroplastos
y menor lignificación de las células, lo que está directamente relacionado con
el incremento de la excreción de los compuestos fenólicos al medio de cultivo.
·
Los cambios
estructurales y bioquímicos permiten establecer la relación entre la cantidad
de cloroplastos en las células del parénquima clorofílico de las hojas de los
brotes in vitro y la excreción de
compuestos fenólicos al medio de cultivo.
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