La caña de azúcar es la mayor fuente de azúcar en el mundo, actualmente es un cultivo híbrido como resultado de cruces entre seis diferentes especies del género Saccharum. La semilla botánica se produce como resultado de la polinización de las flores de caña de azúcar, es muy pequeña, menos de 1 mm de largo y se forma en las inflorescencias plumosas en los extremos de los tallos. Cada semilla tiene una cubierta de pelillos sedosos que permiten atrapar el aire para permitir su dispersión. Las especies parentales de esta planta producen abundantes semillas pero muchos cultivares son mayormente estériles y éstas no se utilizan en el establecimiento de plantaciones comerciales ya que no producen individuos iguales a sus padres, en su lugar, son utilizadas en el proceso de hibridación para la búsqueda de genotipos sobresalientes que se adapten satisfactoriamente a los diversos ambientes productivos, mediante la identificación y aplicación de nuevas y mejores combinaciones híbridas, lo que constituye la parte esencial de la labor de mejora genética de la caña de azúcar (Chaves-Solera, 2016Chaves-Solera, M. A. (2016). La mejora genética de la caña de azúcar en Costa Rica. 28, Costa Rica.).
Existen pocos estudios sobre microbiota acompañante de la semilla botánica de caña de azúcar, informándose una gran cantidad de patógenos que afectan la germinación y desarrollo de las posturas, constituyendo causa de problemas en el proceso de mejoramiento genético según Hernández-Medina & Heredia (1997)Hernández-Medina, C., & Heredia, I. (1997). Microflora asociada a la semilla botánica de caña de azúcar en 9 combinaciones de la campaña de hibridación de 1992-1993. AgroEnfoque, 88, 58., sin embargo, no existen informes sobre endófitos beneficiosos asociados a esta semilla.
En el caso de los cultivos no leguminosos como la caña de azúcar, los estudios sobre endófitos fijadores de dinitrógeno atmosférico han tomado un gran impulso principalmente sobre la base de las potencialidades de bacterias como Gluconacetobacter diazotrophicus, la cual, debido a sus características ha sido ampliamente estudiada hasta llegarse a la secuenciación total de su genoma según Hearlache et al. (2000)Hearlache, T. C., Kent, A. D., Riggs, P., Iñiguez, A., Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). The Gluconacetobacter diazotrophicus genome project. 82. y constituir un microorganismo base de diferentes productos biofertilizantes desarrollados a nivel mundial y en Cuba como el bioproducto+ el ICIBIOP-GLU, fruto de la colaboración estas investigaciones entre el INICA y el ICIDCA (González et al., 2020González, M., De León, M. E., Rodríguez, M., & Noy, A. (2020). Tecnologías y buenas prácticas para el manejo de los cultivos,. Manual publicado por el INICA, La Habana, Cuba.). La confirmación de esta hipótesis coadyuvaría a un mejor desarrollo de las posturas que se incorporan al largo proceso de obtención de futuras variedades comerciales (INICA, 2011INICA. (2011). Manual de Normas y Procedimientos del Programa de Fitomejoramiento de la Caña de Azúcar en Cuba, capítulo 5 [Manual de Normas y Procedimientos]. Instituto de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA), La Habana, Cuba.).
El objetivo de este trabajo, por tanto, se centró en detectar la presencia natural de esta bacteria benéfica en la semilla botánica, aspecto sobre el cual no existen trabajos previos publicados a nivel mundial.
Se estudiaron muestras de semilla botánica procedentes de 14 cruces obtenidos en el Centro Nacional de Hibridación de Sancti Spíritus que se relacionan a continuación (Tabla 1):
Las muestras previamente conservadas en refrigeración a 4°Celsios, fueron minuciosamente despojadas de las pelusas acompañantes y de las minúsculas semillas se tomaron 500 mg de cada cruce, colocándose las mismas en tubos estériles de 1.5 mL con tres balines de vidrio para maceración en equipo Fast-Prep (MP Biomedicals LLC, Santa Ana, Ca. USA) a 8000 rpm durante 2 minutos. Posteriormente se extrajeron los de ácidos nucleicos totales mediante el protocolo del (Aljanabi et al., 1999Aljanabi, S. M., Forget, L., & Dookun, A. (1999). An improved and rapid protocol for the isolation of polysaccharide-and polyphenol-free sugarcane DNA. Plant Molecular Biology Reporter, 17(3), 281-282.). La calidad fue comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa a 2%, lo cual permitió realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) con el objetivo de detectar la posible presencia de Gluconacetobacter diazotrophicus en las muestras por amplificación del gen 23S ADNr de esta especie utilizando los cebadores específicos G1 (5´-GTTGGCTTAGAAGCAGCC-3´ y G2 (5´-TGCGGCAAAAGCCGGAT-3) Kirchhof et al. (1998)Kirchhof, G., Baldani, J. I., Reis, V. M., & Hartmann, A. (1998). Molecular assay to identify Acetobacter diazotrophicus and detect its occurrence in plant tissues. Canadian Journal of Microbiology, 44(1), 12-19., que producen una banda característica de 491 pb. La mezcla de reacción para volumen final de 12 µL se conformó de la siguiente forma: ADN-0,5 µL; G1-0.25 µL; G2-0.25 µL; Master fix -2.00 µL y agua MilliQ-9.00 µL. La PCR se llevó a cabo en un termociclador BOECO, TC-PRO (Hamburgo, Alemania), utilizando el programa: 94°C-3 min; (94°C-0.30 min, 56°C-0.30 min, 70°C-1 min) 40 ciclos; 72°C-5 min y 4°C. Las bandas obtenidas se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% en un transiluminador ultravioleta (Vilmer Lourmad, Francia) y se utilizó el marcador de peso molecular (Ladder 100 pb Promega).
Se lograron ácidos nucleicos de calidad como se observa en la (Fig. 1) a excepción de la muestra 2, que debió confrontar algún problema en la mezcla de reacción.
La Figura 2 muestra los resultados negativos de la PCR para la amplificación del gen 23S ARNr específico de G. diazotrophicus, al no observarse en ninguna de las muestras la banda de 491 pb esperada como si se observan para los controles positivos empleados, confirmándose la ausencia del endófito en la semilla de los 14 cruces estudiados.
Los pocos estudios publicados sobre microbiota asociada a la semilla botánica de caña de azúcar han informado patógenos fúngicos de los géneros: Drechalera, Fusarium, Curvularia, Alternaria, Phoma, Nigrospora y Epicoccum, con los mayores porcentajes de afectación causados por Fusarium semitectum, Alternaria tenuissima y Alternaria longissima según Hernández-Medina & Heredia (1997)Hernández-Medina, C., & Heredia, I. (1997). Microflora asociada a la semilla botánica de caña de azúcar en 9 combinaciones de la campaña de hibridación de 1992-1993. AgroEnfoque, 88, 58., pero no existen hasta el momento informes sobre bacterias benéficas asociadas a esta semilla o intentos, como en el caso que nos ocupa, de detectarlas.
G. diazotrophicus además de su capacidad de fijar dinitrógeno atmosférico suma las siguientes características: producción de fitohormonas auxinas y giberelinas según Fuentes-Ramírez et al. (1999)Fuentes-Ramírez, L. E., Caballero-Mellado, J., Sepúlveda, J., & Martínez-Romero, E. (1999). Colonization of sugarcane by Acetobacter diazotrophicus is inhibited by high N-fertilization. FEMS Microbiology Ecology, 29(2), 117-128.; Jiménez-Salgado et al. (1994)Jiménez-Salgado, T., Aparicio, R., & Caballero-Mellado, J. (1994). Detección de citocinas en Acetobacter diazotrophicus aislado de caña de azúcar. Reunión Latinoamericana de Rhizobiología, La Habana, Cuba.; capacidad de solubilización de zinc y fósforo, micro y macronutrientes respectivamente, de crucial importancia en el crecimiento, desarrollo y rendimiento de muchas plantas según Saravanan et al. (2007a)Saravanan, V. S., Kalaiarasan, P., Madhaiyan, M., & Thangaraju, M. (2007). Solubilization of insoluble zinc compounds by Gluconacetobacter diazotrophicus and the detrimental action of zinc ion (Zn2+) and zinc chelates on root knot nematode Meloidogyne incognita. Letters in applied microbiology, 44(3), 235-241.; antagonista de importantes patógenos de la caña de azúcar como Xanthomonas albilineans y Colletotrichum falcatum, agentes causales de la escaldadura foliar y pudrición roja respectivamente (Arencibia et al., 2006Arencibia, A. D., Estevez, Y., Vinagre, F., Bernal, A., Perez, J., Carmona, E., Hemerly, A. S., & Santana, I. (2006). Induced-resistance in sugarcane against pathogenic bacteria Xanthomonas albilineans mediated by an endophytic interaction. Int Soc Sugarcane Tech, 8(4), 272-280.; Muthukumarasamy et al., 2000Muthukumarasamy, R., Rebathi, G., & Vadivelu, M. (2000). Antagonic potential of N 2-fixing Acetobacter diazotrophicus against Colletotrichum falcatum Went, a casual of red-rot of sugar. Current Science, 78, 1063-1065.; Piñón et al., 2002Piñón, D., Casas, M., Blanch, M., Fontaniella, B., Blanco, Y., Vicente, C., Solas, M. T., & De León, M. E. (2002). Gluconacetobacter diazotrophicus, a sugar cane endosymbiont, produces a bacteriocin against Xanthomonas albilineans, a sugar cane pathogen. Research in Microbiology, 153(6), 345-351.). Otros informes han demostrado además su acción indirecta contra el nemátodo Meloidogyne incognita (Saravanan, et al. (2007b)Saravanan, V. S., Osborne, J., Madhaiyan, M., Mathew, L., Chung, J. B., Ahn, K. S., & Sa, T. M. (2007). Zinc metal solubilization by Gluconacetobacter diazotrophicus and induction of pleomorphic cells. Journal of microbiology and biotechnology, 17(9), 1477-1482. y algunas especies del hongo Fusarium sp (AP & PP, 2011), aspectos que convierten a esta bacteria en un micoorganismo multiefecto.
Los sitios de colonización de G. diazotrophicus y su distribución en el interior de la caña de azúcar aún no se han esclarecido totalmente. Se ha demostrado que coloniza los espacios intercelulares de la raíz y los vasos del xilema (Fuentes-Ramírez et al., 1999Fuentes-Ramírez, L. E., Caballero-Mellado, J., Sepúlveda, J., & Martínez-Romero, E. (1999). Colonization of sugarcane by Acetobacter diazotrophicus is inhibited by high N-fertilization. FEMS Microbiology Ecology, 29(2), 117-128.). Otros estudios señalan que se localiza en espacios intercelulares del tallo correspondientes al apoplasto de plantas adultas (Dong et al., 1994Dong, Z., Canny, M. J., McCully, M. E., Roboredo, M. R., Fernández, C. C., Ortega, E., & Rodés, R. (1994). A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems. A new role for the apoplast. Plant Physiology, 105, 1139-1147.). La dispersión en el interior del cultivo ha sido también motivo de discrepancia. Algunos trabajos sugieren que G. diazotrophicus se dispersa en los tejidos internos a través de los vasos del xilema según Hernández & Heredia (1997)Hernández-Medina, C., & Heredia, I. (1997). Microflora asociada a la semilla botánica de caña de azúcar en 9 combinaciones de la campaña de hibridación de 1992-1993. AgroEnfoque, 88, 58. y en otros se objeta que ésta sea la vía de dispersión, argumentando que existen barreras morfológicas que impiden la comunicación del xilema de un entrenudo a otro (Dong et al., 1994Dong, Z., Canny, M. J., McCully, M. E., Roboredo, M. R., Fernández, C. C., Ortega, E., & Rodés, R. (1994). A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems. A new role for the apoplast. Plant Physiology, 105, 1139-1147.). Al respecto, Dong et al. (1997)Dong, Z., McCully, M. E., & Canny, M. (1997). DoesAcetobacter diazotrophicusLive and Move in the Xylem of Sugarcane Stems? Anatomical and Physiological Data. Annals of Botany, 80(2), 147-158. observaron que, en condiciones de transporte activo, las bacterias penetran al xilema y son transportadas a través de éste, aunque se determinó que la acumulación de ellas en los entrenudos provoca la no funcionalidad de la estructura. Otros estudios plantean que prefiere los espacios intercelulares y tejidos vasculares como el xilema Dong et al. (1997).Dong, Z., McCully, M. E., & Canny, M. (1997). DoesAcetobacter diazotrophicusLive and Move in the Xylem of Sugarcane Stems? Anatomical and Physiological Data. Annals of Botany, 80(2), 147-158. Ortega & Rodés (1994)Ortega, E., & Rodés, R. A. (1994). Nitrogen fixing endophyte of sugarcane stems. Plant Physiol., 105, 1139-1147. por su parte, encontraron las mayores poblaciones en la zona apical de los tallos.